一、样品制备的核心原则
原子力显微镜制样的核心在于"干净+固定"：样品表面需无污染物（避免探针污染和成像干扰），且B须牢固固定在基底上（防止扫描过程中移位）。对于生物样品，还需特别注意维持其活性与结构完整性。
二、生物样品制备的关键步骤
1. 基底选择与预处理
云母片：层状结构，剥离后表面原子级平整，适合蛋白质、DNA等生物大分子。
预处理：新鲜剥离Z外层，无需额外清洗。
硅片：适用于需要导电性的样品。
预处理：浓硫酸与双氧水混合液（7:3）在90℃下清洗1小时，去除有机物。
导电基底：镀金/铂的基底或导电银浆固定样品，确保电学测试准确性。
2. 生物样品预处理
通用清洁：用PBS缓冲液清洗样品，去除盐分和杂质，避免结晶干扰成像。
活细胞制备：
固定方法：
2.5%戊二醛固定10分钟后氮气吹干（传统方法）。
琼脂糖凝胶固定法（推荐）：对细胞损伤小，维持原始状态。
理想状态：细胞覆盖率50%~70%，贴壁生长且吸附牢固。避免死细胞（易移位）或过密堆积（影响成像）。
蛋白质与DNA：
蛋白质：调节溶液pH值低于等电点，使其带正电后吸附在带负电的云母表面。
DNA：加入Mg²⁺等二价阳离子增强与云母的吸附，或通过硅烷化试剂修饰云母表面为氨基结尾（带正电）。
3. 样品固定与沉积
滴涂法：将样品溶液滴至基底，静置10分钟后氮气吹干。
分散法：粉末样品超声分散于酒精/丙酮中，滴至云母片后加热烘干。
功能化基底：通过化学修饰（如聚赖氨酸）增强基底与样品的相互作用，适用于活细胞或需要长期稳定的样品。
4. 液体环境成像特殊处理
直接浸泡：将样品完全浸泡在液体中，注意液体高度不超过保护套高度。
凝胶固定：使用琼脂糖凝胶固定细胞，防止其在液下环境中随探针滑动。
基底修饰：聚赖氨酸修饰基底表面，通过静电作用固定带负电的细胞。
三、AFM原子力显微镜操作模式选择
模式 | 适用场景 | 注意事项 |
接触模式 | 硬质材料（如陶瓷、金属） | 力较大（10⁻¹⁰～10⁻⁶ N），可能损伤柔软样品，不适合活细胞或易变形样品。 |
轻敲模式 | 生物样品、聚合物、液体环境 | 探针周期性接触样品，侧向力小，推荐用于活细胞和易碎样品。 |
非接触模式 | 超软样品（如脂质双层） | 室温下难以实现，因空气中的水会形成毛细桥，增加探针与样品的压力。 |
四、环境控制与数据校正
湿度控制：保持环境湿度≤40%，避免非接触模式中水膜干扰。
数据校正：
背景扣除与平面拟合：消除倾斜误差。
表面粗糙度（Ra/Rq）、台阶高度、杨氏模量（通过力曲线计算）。
探针保护：避免频繁更换探针，轻敲模式探针寿命约1-2周。
五、常见问题与解决方案
样品移位：
确保基底清洁且样品固定牢固（如使用导电银浆或化学修饰）。
活细胞可采用琼脂糖凝胶固定或聚赖氨酸修饰基底。
成像伪影：
避免样品干燥不均匀（如粉末样品需超声分散后滴涂）。
蛋白质样品需冲洗去除盐类杂质（图8→图9效果对比）。
活性维持：
活细胞制备后尽快成像，减少在非生理环境中的暴露时间。
液下成像时控制温度与pH值，模拟生理条件。
原子力显微镜生物样品制备需兼顾固定性与活性维持，通过选择合适的基底、预处理方法及操作模式，可获得高质量的纳米级成像数据。实际操作中需根据样品类型（如细胞、蛋白质、DNA）灵活调整参数，并结合环境控制与数据校正技术，以Z大化实验结果的可靠性与分辨率。